产品描述：

检测原理

细胞在发生凋亡时,会在生理生化和细胞形态上发生一系列变化,在凋亡中晚期,激活的DNA内切酶会切断核小体间的基因组DNA,DNA会被降解成为约180bp-200bp的片段,而正常或者增殖细胞很少发生DNA断裂。利用这个差异,用脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT 酶)把Biotin标记的dUTP标记到断DNA片段的3’ -OH末端,用POD检测标记并用底物显色,然后进行显微镜观察,这个方法被称为TUNEL法细胞凋亡检测。

· 应用范围广,既可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况,也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。

 

检测方法:显微镜

 

样本类型:石蜡包埋组织切片、组织冰冻切片、细胞涂片以及贴壁细胞

 

储存条件:试剂盒需储存在”0℃ 非无霜冰箱中,避免反复冻融。建议分装保存Biotinˉ标记反应混合物。

 

注意事项

· 为了避免试剂损失,使用前可以低速短暂离心融化后的试剂,然后小心开管取用

· 试剂盒使用后尽快放回讫0℃冰箱保存

·TUNEL反应液即用即配,不能配制好后存放

·TdT酶在-20℃保存时不会凝固,不需要提前取出融化,只需在使用前迅速从-20℃冰箱中拿出取用后立即放回-20℃保存

·POD反应液用POD贮液和POD稀释液即用即配,配制好后可以4℃保存(3个月),POD可以-20℃保存

·标记反应混合液包含二甲胂酸钾(potassium ca∞dy1ate),避免接触皮肤和眼睛，操作时戴好手套

· 如果用于石蜡切片的检测,需用蛋白酶K,二甲苯处理;

· 在标记反应中,推荐使用盖片或封口膜覆盖样本,保证反应液均匀分布,并避兔孵育过程中缓冲液蒸发损失。准备覆盖膜时,可剪下一片Parafn封口膜,使其稍大于样本,并将一角折起便于在接下来实验步骤中取放

·用塑料或玻璃容器及纸巾自制湿盒,在样本处理过程中使用湿盒保持样本环境的湿润,一定避免样本干燥:

·固定样品,需自备多聚甲醛;

· 悬浮细胞可用以下方法固定或贴附在玻片上；4°c缓慢离心(1000rpm)5分钟,去除细胞培养上清,并将细胞重新悬浮在4%的甲醛溶液(溶于1×PBs溶液)使其终密度为1×10的六次方/m1,室温孵育10分钟。按照上述方法离心收集细胞,去除固定液并用80%乙醇溶液以相同细胞密度重悬。固定后的细可以保存在4° 固定后的细胞(100-300u1)可直接固定在玻片上,使用聚卜赖氨酸包被的玻片可以提高细胞的黏附性。

 

试剂盒组分

(1) Biotin-标记反应混合物(BiotinˉLABELING REACTION MIX) : Biotin- dUTP和未标记的dNTp以最佳的比例混合,在末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT酶)的作用下标记DNA3’ -OH末端

(2)TdT (TdT ENzYME):将标记和未标记的脱氧核糖核苷酸掺入断裂的DNA3DNA3’ -OH末端

(3)POD (⒛x):SA-HRP,用于结合Biotin-DNA,并通过HRP催化底物显色。

(4)POD稀释液:用于稀释POD。

(5)蛋白酶K:1mg/mL

 

操作流程

一、石蜡包埋组织切片处理流程

A.样本的脱蜡处理

1、室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡5分钟。更换新的二甲苯再浸泡5分钟以彻底脱掉石蜡。

2、室温下用100VO乙醇浸泡切片5分钟,更换新的100%乙醇再浸泡5分钟。

3、室温下用梯度乙醇(90、80、70%)各浸洗1次,每次2分钟,逐渐增加水分。

4、用PBS轻轻润洗切片,并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。这时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓,便于下游透性处理和平衡标记操作。

注意：在实验过程屮切勿让样本干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

B.增加样本的通透性

1、用PBs溶液配置终浓度为20ug/ml的蛋白酶K(不含DNase活性),每个样本需要100uL蛋白酶K溶液。

2、每个样本上滴加100uL浓度为⒛ug/ml的蛋白酶K溶液,使其被全部覆盖,室温孵育20分钟

注意：严格控制孵育时间，孵育时间过长可对细胞造成伤害，过短可能造成通透处理不充分，影响标记效率。蛋白酶K工作液使用浓度、处理时间及温度，因组织或细胞的类型或者固定的方法不同而有所不同，使用者可以参照试剂盒提供的说明摸索实验条件。

3、用PBS溶液润洗样本三次。

4、轻轻去掉多余液体,并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

C.配制标记反应液:

组分比例	1个样品	10个样品	⒛个样品
Biotin-标记反应混合物	48 uL	480 uL	960 uL
TdT酶(25x)	2 uL	20 uL	40 uL
标记反应液	50 uL	500 uL	1000 uL

注意：为了减少试剂损耗，打开管子前请离心。标记反应充分混匀，且一次性用完，不能储存。

D.标记反应

1、洗涤样品一次,轻轻吸干样本周围的缓冲液,注意不要触碰到样本。

2、在每个样本上立即滴加50ul上述准备的TdT标记反应混合物。

3、用预先裁剪好的比样本稍大的封口膜覆盖样本。

注意：可将封口膜折起一角，便于取放。封口膜的使用不仅可以确保反应混货物均匀分布，可以减少在孵育国产中的蒸发

4、将切片置于湿盒中于37℃孵育6O-90分钟。

E．显色与结杲评断

1、移走 封口膜,并将切片置于PBs溶液中室温孵育1分钟。

2、轻轻去掉多余液体,换用新鲜的PBs溶液室温孵育1分钟。

3、用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的PBs溶液。

注意： 为了降低背景，载玻片在用pbs洗一遍之后，可再用含有0.1% Triton-100和2mg/mlbsa的pbs洗3次，每次5分钟；这样游离末端未反应的标记物清除比较干净

4、洗涤样本,将载玻片浸入去离子水中,室温放置5分钟。重复两次,总共洗三次。

可选：用3%BSA  PBS封闭液室温放置20分钟。

5、滴干载玻片上多余的水并且用吸水纸擦拭细胞周边的区域。

6、用POD稀释液,配制POD溶液(1：25-50稀释),在每个样本上滴加50uL POD溶液,37℃放置30分钟。

7、DAB显色液A和B混合用PBS稀释成1X工作液。PBS洗涤载玻片3次后,加入50-100ul DAB底物或者其他POD底物,室温放置10分钟。

8、PBS洗涤载玻片3次,除去多余底物后,显微镜下分析样本。

 

二、组织冰冻切片处理流程

该操作流程与石蜡包埋组织切片相似,除了将脱蜡步骤替换为固定和短暂的水化步骤,并将蛋白酶K的处理时间缩短到10分钟。在进行该实验检测前需固定冰冻组织。为了避免在清洗步骤中的样本在玻片上损失,建议不用洗瓶清洗,而是将玻片浸在PBS溶液中2-3次进行清洗。

注意夕在操作中避免样本千燥

A．组织固定与水化^```

1、将玻片浸没在4%多聚甲醛溶液(溶于PBS)中,室温孵育15分钟。

2、轻轻去掉多余液体,并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。

3、将玻片浸没在PBs溶液中,室温孵育15分钟。

4、轻轻去掉多余液体,并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。这时可用疏水笔在样品，周围描绘样品分布的轮廓,便于下游透性处理和平衡标记操作。

B．增加样本通透性

并将蛋白酶K的处理时间缩短到10分钟,其他同于(一、B) C,D.E。同于一

 

三、固定细胞片处理流程

该操作流程与冰冻组织切片相似,除了将蛋白酶K的处理时间缩短到5分钟。将悬浮细胞固定到玻片上的操作请参考““注意事项”章节。为了避免在清洗步骤中的样本在玻片上损失,建议不用洗瓶清洗,而是将玻片浸在PBs溶液中2-3次进行清洗。

注意：在操作中避免样本干燥。 

 

四、可选

A.设立阳性对照

1、DNase I染液配置3000U/ml或者1mg/m1 in PBs, 1mM Mgs04 and 1mg/m1 BSA

2、取经过预处理(己完成固定和通透性处理)的细胞,用DNase I处理,室温孵育10分钟。

B,设立阴性对照

在配置E中的标记反应液时,不加TdT酶。

 

常见问题

1.非特异性染色

a.有些细胞或组织,核酸或者聚合酶活性水平较高,导致出现非特异性光标记。

建议：细胞或组织后立那鲅,爿阴止这些酶暑豸赝阳晤'或者用ddUTP和dAΓP封闭样晶。

b.样品包埋或者固定过程中,由于试剂原因或者方法不当,造成DNA断裂。

建议：更换试剂或者改变包埋固定方法。

c,TUNEL反应时间过长,或细胞或组织表面不能保持湿润,也可能出现非特异性染色。

建议：注意控制反应时阃,或者减少TdT的用量(标准量的20-50%丿'并始终确保样品湿润。

d,内源性POD液可能会影响背景。

建议：样品通透处理前,用3%的双氧水甲醇浸泡样品10分钟。

e.POD非特异结合

建议:用3%的BSA的PBS封闭样品,室温10分钟,或者POD溶液比标准量稀释2-3倍后使用。

 

2.背景很高

     a.支原体污染。

     建议：使用支原体检测试剂盒看看是否是污染。

     b.高速分裂和增殖的细胞,有时也会出现细胞核中的DNA断裂,产生较多3’ -OH末端。

     建议：凋亡晚期检测，同时减少tunel的反应时间

3.标记效率低

     a.样品固定时间过长,导致交联程度过高。

     建议：适当咸少固定时间，或者采用2%多聚甲醛溶液(溶于PBS)

     b.组织样品通透不足

     建议：延长孵育时间，或者提高孵育温度,尝试0.1M柠檬酸钠60℃处理30分钟。

 

 

文献：

1、Overexpression of the clock gene Per2 suppresses oral squamous cell carcinoma progression by activating autophagy via the PI3K/AKT/mTOR pathway   J Cancer 2020; 11(12):3655-3666. doi:10.7150/jca.42771  IF:4.207