产品描述：

活细胞/死细胞双染试剂盒

 

产品货号	产品名称	包装
MBR111	活细胞/死细胞双染试剂盒	500T

 

产品简介：

Calcein-AM 是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM 由于在Calcein 的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为 Calcein 留在细胞内，发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如 BCECF-AM 和 Carboxy- fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM 是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein 的激发和发射波长分别为 490 nm 和 515 nm。Calcein -AM 仅对活细胞染色。

碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI仅对死细胞染色。

   

试剂盒组成：

 

货号	名称	规格	保存
MBR111-A	染色液 Calcein AM	100ul	-20℃，避光
MBR111-B	染色液 PI Solution	200ul	2-8℃，避光
MBR111-C	染料稀释液	10ml	2-8℃，避光

 

 

使用方法：

1．螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

2．细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

3．试剂 A 为 DMSO 溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。

4．试剂 A 为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。

5．由于 Calcein-AM 的稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。

 

染色工作液的配制：

1．根据样品数按下列比例配制染色工作液。

2．用染料稀释液试剂 C 将染色液 A 和B 分别 10 倍稀释。

3．每 10ml HBSS 缓冲液或无血清培养基中加入 100μl 稀释过的染色液 A，充分混匀，即成染色工作液 A。

4．每 10ml HBSS 缓冲液或无血清培养基中加入 20-200μl 稀释过的染色液 B，充分混匀，即成染色工作液 B。

收集样本细胞：

1．用 PBS 洗涤细胞两次。

2．用 200μl 染色工作液 A 将细胞重悬。

3．在室温或 37℃避光孵育 15-20 分钟。

4．用 PBS 洗涤细胞。

5．用 200μl 染色工作液 B 将细胞重悬。

6．在室温或 37℃避光孵育 2-5 分钟。

7．用 PBS 洗涤细胞。

8．用适量 PBS 重悬细胞。

9．用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。最大激发为 490nm和535nm，最大发射波长为 515nm 和 617nm。

 

操作步骤

1．标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；。

2．加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3．加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

4．温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

5．配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6．洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7．显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

8．终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

9．测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

 

注意事项：

1．长期不用可以-20℃保存。

2．染色液 Calcein AM 注意防潮；避免反复冻融。

3．染色液 A 为 DMSO 溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。

4．注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。

5．试剂 B 溶解后需要用吸头吹打混匀。

6．试剂拆封后请尽快使用完！