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产品名称:Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒
英文名称:
产品编号:MBR120 产品包装:50次 产品价格:1299

产品描述:

        Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒是用FITC标记的Annexin V作为探针,来检测细胞早期凋亡的发生。

 

         其检测原理为:在正常的活细胞中,磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,但在早期凋亡的细胞中,PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36 kDa的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合,可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

          本试剂盒中还提供了碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。PI是一种核酸染料,它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜,但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此,将Annexin V与PI联合使用时,PI 则被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)之外,而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性(Annexin V+/PI+)。

        本试剂盒可用于流式细胞仪、荧光显微镜进行检测。

 

 

运输与保存方法

冰袋  运输。-20℃避光长期保存,避免反复冻融。

【注】:如果需要在短时间内多次重复使用,可以在4℃避光保存,半年有效。

 

注意事项

1)由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。

2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤。胰酶消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤;PI摄入过多,消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后,轻摇使胰酶与细胞充分接触,然后倒掉大部分胰酶,利用剩余少量胰酶再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。

3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定前需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用Binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。

4)如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。

5)试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。

6)Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。

 

操作方法

1.1 样品染色

1)悬浮细胞:300 g,4℃离心5 min收集细胞。

贴壁细胞:用不含EDTA的胰酶消化后,300 g,4℃离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长,以防引起假阳性。

2)用预冷的PBS洗涤细胞2次,每次均需300 g,4℃离心5 min。收集1~5×105细胞。

3)吸弃PBS,加入100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞。

4)加入5 μL Annexin V-FITC和10 μLPI Staining Solution,轻轻混匀。

5)避光、室温反应10-15 min。

6)加入400 μL 1×Binding Buffer,混匀后放置于冰上,样品在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。

为了避免洗涤细胞时损失细胞,在吸液时可以用大的Tip头套上小的Tip头吸液。

 

1.2 样品分析

A.流式细胞仪分析:

        FITC最大激发波长为488 nm,最大发射波长525 nm,FITC的绿色荧光在FL1通道检测;PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm,最大发射波长为615 nm,PI的红色荧光在FL2或FL3通道检测。用CellQuest等软件进行分析,绘制双色散点图(two-color dot plot),FITC为横坐标,PI为纵坐标。典型的实验中,细胞可以分成三个亚群,活细胞仅有很低强度的背景荧光,早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光,晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双重染色。

B.荧光显微镜分析:

1)滴一滴用Annexin V-FITC/PI双染的细胞悬液于载玻片上,并用盖玻片盖上细胞。

对于贴壁细胞,可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。

2)在荧光显微镜下用双色滤光片观察。Annexin V-FITC荧光信号呈绿色,PI荧光信号呈红色

 

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