产品描述：

异硫氰酸荧光素（FITC）

 

产品货号	产品名称	包装
MBQ1016	异硫氰酸荧光素（FITC）	50mg

 

产品介绍：

中文名：	异硫氰酸荧光素
英文名：	Fluorescein isothiocyanate isomer I（FITC）	分子式：	C21H11NO5S
分子量：	389.39	Cas号：	3326-32-7
溶解性：	5mg/ml DMSO

 

保存说明：

4℃干燥避光保存。  

 

使用说明：

1. 标记蛋白

a. 制备溶于0.1 M碳酸钠缓冲液（pH 9）的待交联蛋白样品，浓度≥2 mg/mL。

b. 溶解FITC于无水DMSO配制成浓度为1 mg/mL的溶液，标记实验前新鲜配置FITC溶液，避光。

c. 对于1 mL 蛋白溶液加入50 µLFITC溶液，可按照每次5 µL的量边加边轻轻搅拌蛋白溶液；

d. 待所需FITC加入完毕，将反应液于4℃避光孵育8 h；

e. 加入NH4Cl使其终浓度至50 mM，4℃终止反应2 h；

f. 加入二甲苯青至浓度0.1%，甘油至浓度5%；         

g. 通过大小孔径合适的凝胶过滤层析分离排除未被结合的FITC，分离范围在20000至50000（球蛋白例如抗体）。待凝胶柱平衡后，将以上反应混合液从柱顶注入，打开凝胶柱，待其全部流入柱床后，加入PBS缓冲液。

此时，可以形成两条带：

快速移动带，也就是FITC-蛋白偶联物，先被洗脱，通常于室内光下可看到；

慢速移动带，也就是未结合蛋白的FITC和二甲苯青。仅仅在PBS缓冲液清洗后被洗脱出来。

h. 于4℃避光储存上述偶联物，加入0.1%（w/v）叠氮化钠作为一种防腐剂。若蛋白浓度较低（＜1 mg/mL），可加入1%BSA作为一种蛋白稳定剂。

i. 偶联物中荧光素和蛋白的比值（F/P）可通过测定495 nm和280 nm处的吸光值来鉴定，F/P应位于0.3-1.0。小于该比例则信号太低，高于该比例则背景太高。

2. 荧光素/蛋白摩尔比（F/P）的测定

F/P摩尔比即荧光素蛋白偶联物中FITC与蛋白质的摩尔比。为了计算该值，首先需测定该偶联物在280nm和495nm的吸光值：将已标记蛋白样品置于石英比色皿中，测得A280和A495，注意A280的值需在0.2-1.4之间，如在该范围外，需调整相应标记样品浓度。

a. 对FITC-IgG标记物

F/P摩尔比计算公式为：Molar F/P=[2.77×A495] / [A280-（0.35×A495）]

FITC-IgG偶联物浓度计算公式为：IgG（mg/ml）=[A280-（0.35×A495）] / 1.4

【注】：该处1.4，指的是大多数物种IgG 以浓度为1mg/ml在pH7.0的条件下测得的A280为1.4

b. 对于其他FITC-蛋白质（非IgG）偶联物

F/P摩尔比计算公式为：

 此处

【注】：C对一种蛋白质而言是一常数；

MW是蛋白质分子量；

389是FITC的分子量；

195是FITC偶联物在pH13, 490 nm处的吸光值E0.1%；

（0.35×A495）是基于FITC A280的校正因子；

E0.1%是某一蛋白（1.0 mg/mL）在280 nm处的吸光值

 

注意事项：

1. 待标记的蛋白必须是未被污染蛋白，且溶解蛋白的缓冲液里不能含有叠氮钠或胺类试剂，如Tris、甘氨酸，因为这些试剂会抑制标记反应。如果缓冲液里含有上述试剂，则需将该蛋白溶液在4℃下于PBS，pH 7.4 透析过夜；透析过程中如果pH值过高（＞8.0-8.5）会损害某些蛋白。

2. 勿将碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液存放于0-5℃超过1周，其pH值会发生变化，建议现配现用。

3. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。