产品描述：

ECL化学发光底物（超敏）

产品简介：

        ECL化学发光底物（特超敏）底物可为使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联物的免疫印迹实验提供明亮的信号和低皮克级检测灵敏度。该ECL底物能够兼容各种膜、封闭液和宽范围抗体稀释液，以出色性能、通用性和高性价比，满足用户的免疫印迹应用需求。

 

产品组份：

产品编号	产品名称	规格
MBW129-A	增强型发光液 A液	100ml
MBW129-B	稳定剂 B 液	100ml

 

 

用途：用于HRP标记抗体的Western Blot和HRP标记探针的核酸杂交。

 

产品特点：

1、ECL：用于辣根过氧化物酶(HRP)的增强型化学发光底物;

2、低皮克级灵敏度：检测硝化纤维素膜或PVDF膜上低皮克级的蛋白条带;

3、长信号持续时间：在条件优化情况下，经底物孵育的印迹条带能够持续输出6至8小时的可检测光信号;

4、稳定试剂：工作液在24小时内保持稳定。

5、成像方法— 适用于X射线胶片、CCD或激光成像仪

6、价格经济— 针对稀释的抗体浓度条件进行了优化：

0.2至 1.0 µg/mL一抗（以1 µg/mL储存液稀释1:1,000至1:5,000倍）

10至 50 ng/mL二抗（以1 µg/mL储存液稀释1:20,000至1:100,000倍）

 

重要提示：

为获得最佳效果，必须优化该系统的全部组分，包括样品量、一抗和二抗浓度以及膜和封闭试剂的类型。

Ø  使用该产品比使用沉淀比色 HRP 底物检测所需的抗体浓度低。为优化抗体浓度，请进行一次系统的点印迹分析。

Ø  没有一种封闭试剂对所有系统而言都是最佳的，所以为每一个免疫印迹检测系统找到最合适的封闭缓冲液非常必需。封闭试剂有可能与抗体产生交叉反应，导致出现非特异性信号。封闭缓冲液同时也会影响系统的灵敏性。当从一种底物转换为另一种底物时，有时会出现信号衰减或背景增加的现象，原因可能是封闭缓冲液不适合新的检测系统。

Ø  使用亲和素/生物素检测系统时，避免使用牛奶作为封闭试剂，因为牛奶中含有不定量的内源性生物素，会导致高背景信号。

Ø  保证洗涤缓冲液、封闭缓冲液、抗体溶液和底物工作液的使用体积，以确保在整个实验过程中印迹膜完全被液体覆盖，避免膜变干。增大封闭缓冲液及洗涤缓冲液的使用量可以降低非特异性的信号。

Ø  为获得最佳效果，在孵育步骤请使用摇床。

Ø  将 Tween20(终浓度 0.05-0.1%)加入封闭缓冲液和稀释的抗体溶液，以降低非特异信号。使用高品质的产品，如去污剂。它保存在安瓿中，过氧化物和其他杂质含量很低。

Ø  不要使用叠氮钠作为缓冲液的防腐剂。叠氮钠是 HRP 的抑制物

Ø  避免手与膜直接接触，实验过程应戴手套或使用干净的镊子

Ø  所有设备必须清洁且不沾染外来物质。金属器械（如剪刀）不得具有可见的锈迹。锈迹可能导致斑点形成和高背景。

Ø  底物工作液在室温下可稳定 8 小时。日光或任何其他强光下可能损害底物，为获得最佳结果，将底物工作液保存在琥珀色瓶中，并避免长期暴漏在任何强光下，短时间暴漏于实验室常规照明不会损害该工作液。

 

使用方法:

 

蛋白印迹法详细操作步骤

1) 将印记膜从蛋白转印设备中取出，加入合适的封闭液在温室下孵育 20-60 分钟，同时振荡。以封闭膜上非特异性蛋白结合位点。

请注意：使用在前文建议的抗体稀释度是非常重要的。

2) 将膜从封闭液中取出，与一抗工作液在温室孵育 1 小时，同时振荡；或在 28℃孵育过夜，不振荡。

3) 将足量的洗涤缓冲液加至膜上，保证缓冲液将膜完全覆盖。振荡孵育≥5 分钟，更换洗涤缓冲液并重复该步骤 4-6 次。增加洗涤缓冲液体积，洗涤次数和洗涤时间有助于降低背景信号。

注：孵育前，膜在洗涤缓冲液中的短暂淋洗会提高洗涤效率。

请注意：使用在前文建议的 HRP 标记二抗稀释度是非常重要的。

4) 将 HRP 标记的二抗工作液与膜在温室孵育 1 小时，同时振荡。

5) 重复步骤 3，以除去未结合的 HRP 标记二抗。 注：膜与 HRP 标记二抗孵育后必须进行彻底洗涤。

6) 将 A 溶液与 B 液等比例混合，制备成工作液。每 cm2 膜使用 0.01～0.1ml 工作液。工作液可以在温室下稳定 8 小时。

 注：曝露于日光或任何其他强光下可能损害工作液，为获得准确结果，将此工作液保存在琥珀色瓶中，并避免长期曝露于任何强光。实验室的常见照明不会损害工作液。

7) 将印记膜在工作液中孵育 5 分钟。

8) 从工作液中取出印记膜，并置于一个塑料片或清洁的塑料纸（膜）中，用一张吸水纸吸除多余的液体，并从印记和塑料纸之间小心地压出气泡。

9) 将包在塑料纸（膜）中的印记膜置于胶片暗盒中，蛋白质面朝上，除适用于胶片曝光的灯（如红色安全灯）之外，关闭所有的灯。

注;胶片必须在曝光期间保持干燥，为获得最佳效果，才去一下措施：

* 确保将多余的底物从膜和塑料纸上完全去除。

* 在整个胶片处理期间，使用手套。

* 切莫将印记膜置于已显影的胶片上，因为胶片上的化学物质会减弱信号。

10) 将 X 光胶片置于膜的上面。建议第一次曝光 60 秒。之后可调整曝光时间以达到最佳结果。化学发光反应在底物孵育后的前 5-30 分钟期间是最强烈的。这一反应可以持续几个小时，但强度会随时间下降，如有底物孵育后较长时间后曝光，曝光时间可能需要延长以获得较强信号。如果使用磷光存储成像设备（如 Bio-Rad 的分子成像仪系统）或 CCD 照相机可能需要较长的曝光时间。

注意：胶片与膜之间的任何移动可能在胶片上造成人为的非特异信号

11) 使用合适的显影剂和定影剂对胶片进行显影。如果信号太强，则缩短曝光时间或将印记膜进行剥离并降低抗体浓度重新检测。