分离后的T细胞通过体外刺激扩增，达到需要的细胞数量用于后续研究。T细胞活化需要两个信号，第一信号是APC表面的MHC-抗原肽复合物与TCR的相互作用和结合，第二信号是微生物产物或者固有免疫针对微生物的应答成分即共刺激分子。第二信号又分为抗原依赖的(需要抗原和来自抗原提呈细胞或抗CD28抗体等的共同刺激)不依赖于抗原的(不需要抗原而是有丝分裂原[PHA或Con A])两种。抗原依赖刺激只扩增抗原特异性的T细胞，而不依赖抗原的刺激则扩增样本培养中的所有T细胞。本文介绍CD3/CD28共刺激扩增T细胞。

试剂和材料

 

注意：此是以人为例，其中种属需要换对应的试剂

 

货号	名称
11875093	RPMI 1640 Medium
MBX102	胎牛血清
214010	L-谷氨酰胺溶液
MBX008	双抗
16-0037-81	CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), Functional Grade, eBioscience™
16-0289-81	CD28 Monoclonal Antibody (CD28.2), Functional Grade, eBioscience™
MBY001	重组人IL-2
MPY008	96孔培养板

 

操作步骤(参考)

1、抗体包被培养板

1. 用无菌PBS制备5-10 µg/mL 的CD3抗体。

2. 在96孔板的条件孔中，每孔加入50 µL抗体溶液。不激活的对照孔加入50 µL的PBS。

3. 紧紧盖上培养板并用Parafilm封口，避免蒸发。然后将其置于37℃培养箱中2小时或者提前一天准备培养板，置于4℃过夜。

4. 接种细胞之前，用移液枪将培养孔中的50 µL抗体吸出。

5. 用 200 µL PBS洗涤培养孔并弃去PBS。

6. 重复步骤5去除所有未交联的抗体。

2、接种细胞

1. 用完全的RPMI 1640培养基重悬T细胞或者被CFSE标记的T细胞至 1x106/mL 。

注：RPMI-1640完全培养基（500mL）：

• 495 mL RPMI-1640

• 5 mL L-谷氨酰胺200 mM（100×）

• 50 ng/mL IL-2

• 抗生素（可选）

2. PBS洗涤包被好的培养孔后，每孔加入100 µL细胞悬液。每个试验条件，设三个复孔。

3. 每孔加入2 ug/mL CD28抗体。

4. 将培养板置于37℃、5% CO2培养箱中孵育。

5. 孵育2-4天。

6. 通过流式检测T细胞扩增。

培养板不包被

 

 

 

1. 试剂配置

RPMI-1640完全培养基（500mL）：

• 495mL RPMI-1640

• 5 mL L-谷氨酰胺200 mM（100×）

• 50 ng/mL IL-2

• 0.5 μg/mL CD3 功能抗体

• 2 μg/mL CD28 功能抗体

• 抗生素（可选）

2. 接种细胞

1) 用完全的RPMI1640培养基重悬T细胞至1×106细胞/mL。

注：优化细胞浓度，从而获得最佳的激活效果。

2) 96孔培养板每孔中加入100 µL细胞悬液。

3) 将培养板置于37℃、5% CO2培养箱中孵育。

4) 对于T细胞的长期培养，每7天收获细胞，用新鲜的培养基将细胞重悬至1×106细胞/mL，重新接种。

5) 通过流式检测T细胞扩增。