1. 取100ul 全血，按照细胞表面抗原染色方法标记CD4 和CD25。根据说明书和抗体管上的标识确定抗体用量。按个人要求设置空白管、对照管、补偿管和样本管。4 ℃孵育30分钟。

2. 用去离子水（不能用PBS）将红细胞裂解液稀释成1×。每管用量为2ml。

3. 染色完的全血不用洗，加2ml 稀释好的红细胞裂解液，迅速混匀，静置8~10 分钟，观察溶液透亮后用预冷PBS 溶液洗涤细胞，1000 rpm离心5 分钟，去上清。

4. 配制固定/破膜工作液，注意要新鲜配制，每管的用量为1ml。

5. 旋涡震荡重悬细胞后加入1ml 的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（1:3 稀释好），并再次旋涡混匀。

6. 避光4℃孵育30 分钟到60 分钟。

7. 将破膜缓冲液用去离子水1:9 稀释，制成工作液。每管的用量为8.5ml。

8. 无需洗涤，直接加入2ml 破膜缓冲液工作液（Permeabilization Buffer）1000 rpm离心洗涤细胞并弃去上清液。

9.（可选）重复第9 步操作洗涤细胞。

10. 加入100 ul PBS 重悬细胞。

11. 加入大鼠血清2 ul，室温避光孵育30 分钟。

12. 加入适量的Foxp3 抗体，对照管中加入适量的同型对照，具体用量参照说明书，避光4℃孵育至少30 分钟。

13. 加入2ml 破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。

14. 重复上一步洗涤细胞。

15. 用适量体积的PBS重悬细胞，并上机检测并分析。

常见颜色搭配：

激光器	检测通道	滤光片配置	滤光片检测发射波长	在检测范围之内的荧光素
488	FL1	BP 530/30	515-545	FITC、AF488、GFP
	FL2	BP 585/42	564-606	PE
	FL3	670 LP	﹥670	PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7
635	FL4	BP 661/16	653-669	APC、AF647

 

常用搭配方案：

CD4-FITC、 CD25-APC、 FoxP3-PE